Industrie Alimentari-XLVIII(2009) aprile, 31-39
L'analisi eseguita comprendeva la ricerca di muffe in tutti i campioni, sia ammuffiti che non. Le metodiche utilizzate comprendevano:
- diluizione decimale del campione e inoculo per inclusione di ogni diluizione decimale;
- insemenzamento diretto - utilizzo di ansa sterile per asportare parte del micelio visibile sui dolci e insemenzamento di questo direttamente al centro di piastre contenenti il terreno di coltura.
Il terreno utilizzato per entrambe le metodiche era costituito da Malt Agar (Malt extract 20 g, Yeast extract 5 g, Agar 20 g, acqua distillata 1 L, pH 6,0), ed era incubato a 30°C per 3-5 giorni. Le colonie, ottenute attraverso le metodiche impiegate, erano purificate in Malt Agar e quindi inoculate in tre differenti Agar: Czapek Dox Agar (Pitt, 1973), Malt Agar e Salt-Malt Agar (Malt extract 5%, NaCl 5%, Agar 2%, pH 6,2) e identificate secondo Ainsworth et al. (1973), Pitt (1987), Pitt et Hochking's (1997) Samson et Pitt (2000) e Samson et al. (2004).
Valutazione dello sviluppo in diverse Aw
La valutazione è stata eseguita in vitro. E' stato utilizzato Agar Malto (Oxoid, Italia) addizionato di dosi crescenti di saccarosio fino ad ottenere valori di Aw pari a 0,80, 0,85, 0,90, 0,95. I terreni erano inoculati tramite ansa con i ceppi isolati e incubati a diverse temperature: 15°, 20°, 25°, 30°. Brevemente con ansa sterile (diametro 0,5 cm) venivano insemenzate centralmente le piastre con spore da colonie cresciute a 25°C per 3 giorni in Agar Malto. Non si esclude che l'Aw potesse essersi modificata in seguito ad un riequilibrio con l'umidità dei termostati. Ciò,comunque, potrebbe rappresentare maggiormente la realtà, essendo l'umidità delle merendine o dei dolci in equilibrio dinamico con l'ambiente esterno o con l'umidità interna alla confezione (es. spostamenti di umidità dal cuore del dolce alla superficie).
Produzione di micotossine in vitro
Sono stati usati diversi metodi per determinare la produzione di micotossine da parte di 87 ceppi isolati dai dolci coreani.
La produzione di aflatossine (B1, B2, G1, G2) è stata valutata inoculando le specie ritenute produttrici in capsule di Petri di vetro Malt extract peptone Agar (20% Malt extract, 0,25% peptone, 2% Agar e 6,5% NaCl). I terreni erano incubati a 28°C per 10 giorni al buio. La metodica di osservazione della fluorescenza e l'estrazione delle micotossine sono riportate da Hara et al. (1974). La produzione di acido ciclopiazonico, di patulina, di Ocratossina A (OTA) è stata valutata inoculando tutti i ceppi ritenuti produttori in Czapek-Dox Agar (CYA; Pitt, 1987) addizionato di 5 g/L di estratto di lievito (Oxoid, Italia). Il terreno inoculato era incubato a 25°C per 10 giorni al buio. Le micotossine erano rivelate in cromatografia su strato sottile. Brevemente l'estrazione delle micotossine: dopo la crescita in substrato Czapek-Dox Agar, le colture erano omogeneizzate in cloroformio/metanolo (2:1, v/v; 50 mL/piastra) e la mistura trattata e filtrata con sodio-solfato anidro. Il filtrato era parzialmente evaporato in rotavapor e seccato sotto flusso di azoto. Quindi l'estratto essiccato era dissolto in 1 mL di cloroformio e 20 uL di questo erano posti su piastre di silica gel (Merck, No. 5554) e confrontate con le soluzioni standard delle diverse micotossine (Sigma, St. Louis, MO, USA). I solventi e i metodi utilizzati per la visualizzazione delle micotossine erano secondo Frisvald et al. (1989) per acido ciclopiazonico; Frisvad (1988) per patulina; Lopez-Diaz et al. (2001) e Paterson et Bridge (1994) per Ocratossina A.
